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原标题:图像细胞术技术与组织分析

五十多年来,流式细胞术一直是生命科学研究和诊断中的一种成熟技术。如果你搜索PubMed,有数十万篇论文使用流式细胞术作为研究和发现的技术。

几十年来,流式细胞术已经发展成为一种能够量化单细胞分子的技术,在这种技术中,今天可以同时染色多达20个甚至更多的标记,并且可以实现真正的标记图谱。

流式细胞术的主要局限性是它只适用于悬浮细胞,因此不能对固体组织切片进行流式细胞术分析。研究人员过去在酶溶液中消化组织块,得到单细胞悬液,然后用流式细胞术进行分析。

这种方法的一个主要缺点是你失去了对形态学的任何赋值。你可以从消化的组织块中测量流式细胞术中的一些细胞,但是你永远不知道特定细胞来自哪里,例如它是在腺体内部还是外部,在肿瘤区域内部,靠近肿瘤区域,还是远离肿瘤区域。

第二个大缺点是,当你在酶溶液中消化活细胞时,这个过程需要12 –
15小时,细胞会对这种消化溶液产生反应,并开始表达一些标记或降解其他标记。

因此,消化15小时后的测量可能与组织中的原始情况不同。作为我在维也纳泌尿外科大学的博士论文的一部分,我在共聚焦激光扫描显微镜上开发了一种原型方法,该方法允许扫描染色的组织切片以获得多种标记,然后在单细胞水平上进行自动化分析。单个细胞通常在核标记上被识别,然后软件测量每个细胞的染色程度。染色显然是指分子标记。

多种染色组合意味着多种标记。然后我们可以获得与流式细胞术相同的东西,单细胞的功能和表型特征,但是这种分析可以在载玻片上的固体组织切片中进行。

尽管流式细胞术只能用于人体的一小部分,因为我们主要由固体组织切片而不是液体组成,但它在全球市场上占有巨大的位置。组织细胞术实际上应该被认为是一个更广泛的市场,而不是一个非常小的利基或特殊的应用。

自从人类基因组计划成功完成以来,我们知道人类基因组包含了3万多个基因,从这些基因中衍生出数万个分子并构建我们的细胞。我在真理教的日子2人体由大约130亿个细胞组成,每个细胞由数千个不同种类的分子组成。这需要调节,以保持如此丰富的分子和细胞在体内平衡。

为了实现这一目标,大自然设计了由不同分子物种组成的调控网络,这些分子物种相互作用。有如此多的网络,每个网络都有许多不同的组成成分和分子类型,以至于今天没有一个网络是完全已知和理解的。

研究人员不断发现已知分子的新分子或功能。信号转导和处理是在已知的信号转导级联中发生的调节网络的例子。这是国际上激烈研究的课题。

每当一种疾病发生时,例如糖尿病或癌症等自身免疫障碍,这意味着某个地方存在不平衡,调节网络无法适当调节组织、细胞、器官,最终无法调节体内平衡。

对于研究人员来说,了解正常组织和患病组织之间的差异是至关重要的,即在正常组织和疾病的不同阶段之间进行比较,例如疾病的早期/前期或后期。在分子水平上理解信号转导级联,从而理解调控程序,意味着仅仅看一两个分子是不够的,因为调控网络由数十个甚至数百个分子/标记组成。

表型表征,或标记谱,意味着同时测量多个标记,是理解导致某一疾病的分子机制的先决条件。反过来,也可以导致开发一种特定的疗法。这就是所谓的个人化医学的基本思想,或者更好的说法是精确医学。

这种我在真理教的日子2疗法不是针对肺癌这样的疾病,而是针对某种导致肺癌的机制。肺癌可由不同的分子机制、不同的遗传缺陷、不同的分子失调引起。我们需要了解的是在分子水平上导致特定患者肺癌的确切机制。

利用组织学开发的工具,单个细胞上的多个标记以及这些细胞之间的相互作用可以在观察者无关的水平上确定和量化。因此,TissueGnostics只提供精密医学的工具。

流式细胞仪分析单细胞悬液。细胞在分析前必须重新悬浮。不过,总有一定程度的配音或多重配音,它们是粘在一起的细胞,流式细胞仪无法作为单一事件进行正确分析。它们通常被拒绝。最重要的是,悬浮细胞总是完整的细胞。

当分析单层细胞时,通常使用均匀的细胞群。这意味着所有细胞类型相同,可能来自单个克隆,培养物中的细胞也是完整的。然而,这与组织切片非常不同。

首先,组织切片总是包含各种不同的细胞,例如上皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、血管、组织浸润白细胞,以及可能处于不同分化阶段的肿瘤细胞。最重要的是,组织切片是一个二维切片,代表了一个实际上的三维物体。

图像细胞术和流式细胞术的另一个很大区别是悬浮细胞趋向圆形。然而,在它们的自然环境中的单细胞,即组织,具有各种形状。虽然在图像中找到圆形是一项相当琐碎的工作,这对于计算机来说很容易解决,但是自动识别数百种不同的形状是一项真正的挑战,其中许多可能发生在同一组织甚至同一图像中。我在真理教的日子2挑战TissueFAXS细胞仪平台。

这一切始于20世纪90年代我的博士论文。我曾接受细胞生物学家的训练,并在维也纳泌尿科医科大学攻读硕士和博士学位。我的第一项工作是用电脑鼠标在显微图像上手工勾勒出每一个细胞的细胞核和细胞质,这需要对成千上万个细胞进行。

我从早到晚这样做了三个星期,直到右手有腱炎,我认为一定有更好的方法可以做到。这是一个发展的起点,多年后,这个发展导致了组织学的建立。

这个基金会成立于2003年,2005年我们成立了子公司tissuengnostics
Romania,这是我们的主要发展分支。我们在洛杉矶的子公司TissueGnostics
USA成立于2007年。2008年,tissuengnostics通过了ISO 13485认证,ISO
13485是医疗器械和体外诊断领域公司的主要质量标准。我们也开始建立我们的国际分销伙伴网络。

我们一直与国内外学术界保持密切合作。多年来,我们与大学合作伙伴一起开展了十多个由政府资助的合作研发项目,这些项目在奥地利由国家资助。到目前为止,我们已经成为欧洲资助的六个大型国际研究项目的合作伙伴。其中有五个居里夫人欧洲培训网。

与学术界的合作非常重要,因为所产生的需求也接近市场需求。由于我也接受过c++和其他计算机语言的软件工程师培训,所以我能够自己开发我们的TissueFAXS细胞术软件的第一个原型。tissuengnostics曾经是第一家提供图像细胞术解决方案的供应商,该解决方案的工作原理类似于具有截止和门的交互式散射图的流式细胞术。

现在专家、技术人员和市场都很清楚,图像分析是一种宝贵的工具,可以用来将图像转换成数据。我们正在进行的图像分析的具体形式称为细胞计数术或组织细胞计数术,因为我们不仅测量细胞的大小、直径或形状,而且通过量化每个细胞的分子标记表达,我们的工具允许用户获得单细胞的功能或表型表征。这些单细胞是组织切片或细胞培养单层的一部分。

TissueGnostics是一个潮流的引领者,帮助市场做好了准备,使科学界越来越认识到显微图像不仅仅是图像,显微镜不仅仅是一个非常昂贵的摄影相机,它也可以用作产生科学数字数据的工具。

我们的技术平台叫TissueFAXS。这个名字的选择与FACS
(荧光激活细胞分类器)相似,因为我们的技术将流式细胞术的思想带到载玻片上,带到组织切片上。

TissueFAXS由高端显微成像硬件组成。我们的软件连接了所有硬件组件(显微镜、扫描台、相机、荧光激发装置、滤光片、转盘、载片机等)。),自动化扫描过程(通过提供组织检测算法、找到焦点、找到焦点位置、计算焦点平衡平面、自动调整设置等。)并将各种图像细胞计数算法应用于虚拟载玻片。

后者——图像细胞术——是我们的核心能力,我们使用一套能够自动识别组织切片中单个细胞的算法。有几种方法,但主要的方法是把细胞核作为“主通道”,然后测量每个细胞核在细胞核内或每个颜色通道中围绕细胞核的染色程度。因此,对每个单细胞进行定量,但是在组织内部可以是任何数量的细胞,甚至数百万个,被识别和定量。

我们为客户提供三大软件包。TissueQuest是荧光样品的单细胞分析平台。免疫组织化学染色单细胞分析平台。高端软件叫做StrataQuest;这是我们上下文图像细胞术的解决方案。StrataQuest可以超越组织学和组织学的分析能力,还可以自动识别血管和腺体等多细胞结构,然后将这些组织学实体与单细胞水平相关联。

我们可以提供自动识别肿瘤区域以及组织浸润/肿瘤浸润白细胞的解决方案。我们的软件可以确定肿瘤内部或基质中肿瘤外部有多少白细胞,例如CD4单个和CD4
/
foxb3双阳性细胞。如果它们在外面,我们甚至可以测量它们离下一个肿瘤结构有多远。

特别是对于我们的StrataQuest平台,我们还提供应用程序、预定义的分析解决方案。根据要求,TissueGnostics还提供定制应用程序的特定解决方案开发服务。StrataQuest应用程序自带图形用户界面,其中显示了调整分析过程所需的一些控制元素,这些元素可能会从一个样品到另一个样品,或者从染色到染色。

应用程序是那些不想开发自己的算法,不想关心工作流设计,而只想提取特定染色数据的用户的解决方案。但是StrataQuest也是一个解决方案,对于那些希望更灵活地开发自己的算法的人来说,它甚至提供了一个与MATLAB或c++库链接的接口,这些库包含用于处理或分割图像的特定代码。

StrataQuest这个名字来自拉丁语单词stradulation,layer,或者多个stradulation,layers,因为StrataQuest提供了分析层。在每一层中,我们可以分析相同的样品,但是在不同的方面。例如,在第一层中,我们识别组织区域,在第二层中,我们识别肿瘤,在第三层中,我们识别所有细胞核,在第四层中,我们识别T辅助细胞并测量与肿瘤区域的距离,在第五层中,我们可以测量肿瘤激活标记,等等。然后将不同图层的分割结果进行组合;你会得到更高级的朗读。

通过我们的软件解决方案,我们可以解决各种用户需求,从简单使用许多样本(这是常规诊断的典型需求),到高度可变的研究问题,每天都可能需要解决新问题并开发新解决方案。

不,一点也不。事实上,甚至没有一个具体的准备程序需要遵循,以允许我们的系统进行分析。可以使用用于免疫组织化学的标准染色方案以及免疫荧光染色的样品。我们的TissueFAXS扫描仪记录信号,我们的图像细胞术解决方案在单个细胞水平上对其进行量化。不需要特殊程序,不需要特殊试剂。

我们的TissueFAXS平台可以处理石蜡包埋组织以及冷冻切片。它可以与细胞培养单层、室载玻片、盖玻片、微孔板一起工作。我们的扫描仪甚至支持超大的载玻片,例如在使用大的组织切片时。我们有倒置系统,可以处理载玻片,也可以处理从6口井到384口井的孔板。

我们所有的荧光系统都可以配备旋转圆盘共焦装置,这样我们就可以提供全滑动共焦成像。我们TissueFAXS家族的最新成员是一种叫做SPECTRA的仪器,它可以用来进行多光谱成像。TissueFAXS光谱允许增加同时染色的标记的数量,并且仍然具有清晰的分离。

在光谱中,我们使用液晶可调滤光器,该滤光器允许在特定波长间隔内检测图像,并制作具有轻微偏移波长间隔的多个图像。这是一个lambda堆叠,类似于共焦显微镜中的z堆叠,在不同焦点位置显示相同的视场。

lambda
stack是一组图像,它们在相同的焦点位置显示相同的视场,但是在不同的光谱间隔。通过使用通常被称为光谱解混的数学,可以提取总组合信号中有多少来自荧光染料1、荧光染料2、荧光染料3、荧光染料4等。我在真理教的日子2特别有用的一种选择是,可以特异性地检测自发荧光,然后将其关闭。

光谱成像是增加标记物数量的非常有力的工具,同时获得更具体的检测,并且去除背景信号,特别是光谱的绿色区域中经常出现的自发荧光是重要的。

TissueFAXS套件由四个应用程序组成:
TissueFAXS获取和管理软件,它控制所有硬件组件并自动执行扫描过程;以及我前面提到的其他三个应用程序——TissueQuest、组织quest和StrataQuest。TissueFAXS扫描仪和TissueFAXS扫描软件获得的虚拟幻灯片与我们的所有应用程序完全兼容。但是,由于TissueQuest软件是荧光染色软件,所以只能分析荧光样品,而stistuequest软件只能分析亮场样品,因为stistuequest仅用于亮场。

我们的图像细胞计量解决方案还支持来自主要第三方载玻片扫描仪的虚拟载玻片,因此我们的分析应用程序也可作为独立解决方案提供,并可为现有载玻片扫描仪安装带来可观的附加值。

还有一个TissueFAXS
Viewer软件可以共享,每个人都可以免费获得。这可用于打开、查看和管理TissueFAXS扫描的虚拟幻灯片。

最后,还有一个TG Web
Viewer应用程序,它允许您将使用TissueFAXS扫描的虚拟幻灯片直接从TissueFAXS扫描软件上载到Web服务器。研究所或医院的管理员授权访问的每个人都可以通过互联网上的常规web浏览器查看这些虚拟幻灯片。

为了确保扫描和分析工作流的再现性,TissueFAXS采用扫描/自动化配置文件。而对于明场样品,仪器的设置或多或少总是相同的,在荧光扫描的情况下有很高的可变性。市场上有许多不同的荧光染料,其具体检测需要在激发、动态范围、滤光器和曝光时间等方面进行调整。生成最佳图像所需的仪器的所有特定设置都可以在自动化配置文件中存储和重复使用。

当用户进行新的实验时,新的一批载玻片用与先前样品相同的方案染色,然后使用相同的扫描设置来产生可比数据。这可以通过使用自动化配置文件来实现和保证。

组织学将继续并扩大研发工作,为全球科学界提供先进的图像和组织细胞计量技术解决方案。我们这样做是我们国际研究合作的一部分,也是基于我们的内部战略产品开发计划。

TissueGnostics以引领潮流的角色开始了它的存在,这也是我们未来想要走的路。创新精神和对研发的持续投入是组织学的重要特征。

几十年来,对免疫组织学和免疫荧光样品的分析一直是手动的,纯粹是视觉上的,并且常常有明显的偏差。

借助基于自动化的组织切片图像细胞术和单细胞水平贴壁细胞培养的工作流程,组织学的产品支持我们的客户——研究科学家——对抗再现性危机。

这样,TissueGnostics就提供了最先进的工具和解决方案,有助于为精密医学铺平道路。

他们可以访问我们的网站:
TissueGnostics.com,我们的社交媒体网站,我们在Facebook和Twitter上,当然还有我们全球用户社区发表的850多份参考文件。请大家联系我们在奥地利、罗马尼亚、美国、香港和北京的办事处,或者我们在全球的任何分销伙伴,您可以在我们的主页上找到完整的列表。

埃克博士是TissueGnostics
GmbH的创始合伙人兼首席执行官,美国TissueGnostics副总裁兼罗马尼亚TissueGnostics公司总经理。TissueGnostics是一家奥地利公司,专注于精密医学解决方案,为生物医学、兽医学和自然科学显微镜样品的高含量和/或高通量扫描和分析提供集成解决方案。

图像细胞术或组织细胞术,不仅测量细胞的大小、直径和形状,而且量化分子标记的表达。

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https://www.news-medical.net/news/20180904/Image-Cytometry-Technology-and-Tissue-Analysis.aspx
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